Zellanalytik

© Fraunhofer IZI-BB
Organ-On-Chip-System: physiologische und kontrollierte Zellkultur in Kombination mit Echtzeitmessungen der Zellvitalität.

Leistungsfähige Verfahren für die Analyse von Zellen ermöglichen einen immer tieferen Einblick in zellbiologische Vorgänge und bilden so die Grundlage für viele medizinische und biotechnologische Anwendungen. Unsere zellanalytische Abteilung bietet einen breiten Bereich an Methoden zur Kultivierung und Analyse von primären Zellen und Zelllinien. Mit modernsten Geräten und Mikroskopen ausgestattete Zellkulturlabore der Sicherheitsstufe S1 oder S2 ermöglichen u.a. das Arbeiten mit Blut und vielen anderen biologischen Zellproben. Wir entwickeln kundenspezifische Verfahren gemäß Ihrer individuellen Anforderungen und Vorgaben und unterstützen Sie bei Ihren präklinischen Forschungsprojekten sowie Arzneimittel- oder Medizinprodukte-Prüfungen.

Leistungsangebot

Design und Entwicklung von Mikrobioreaktoren für die Langzeitkultivierung anspruchsvoller Zellmodelle
Entwicklung mikrofluidischer Systeme zur Sortierung von Zellen und anderen Mikropartikeln
Automatisierte Bildverarbeitung: Charakterisierung und Sortierung von Zellen auf Grundlage ihres mikroskopischen Abbildes bzw. anhand morphologischer Marker
Integration von Mikrosensoren in mikrofluidische Systeme zur Echtzeit-Erfassung von Kenngrößen der Zellmedien (z. B. Sauerstoff, pH-Wert, Glukose)
Verbesserung der Biokompatibilität synthetischer Oberflächen durch Beschichtung mit Polymeren und Biomolekülen und durch thermoresponsive Polymere zur schonenden Zellablösung
Kompetente Verarbeitung und Manipulation einzelner Zellen und kleinster Zellproben in mikrofluidischen Systemen
Etablierung funktionaler Zell-Assays (z. B. Proliferation, Zytotoxizität, Chemotaxis, Neuritenwachstum, Stammzelldifferenzierung, intrazelluläres Calcium, intrazellulärer pH etc.)
Optische Mikroskopie auf High-End-Niveau z. B. hochempfindliche Fluoreszenzmessungen, zeitaufgelöste Fluoreszenzmikroskopie lebender Zellsysteme, oberflächennahe Mikroskopie (TIRF), konfokale Laser Scanning Mikroskopie (LSM)
Zellkultivierung, Zellexpansion und Transfektions-Service

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Projekte

Echtzeitsensorik

Eine Schwierigkeit bei der Beurteilung von Toxizitätsmessungen neuer Substanzen wie z. B. Pharmaka, Kosmetika oder Chemikalien/REACH (Europäische Chemikalienverordnung zur Registrierung, Bewertung, Zulassung und Beschränkung chemischer Stoffe) ist die Untersuchung aussagekräftiger Messgrößen, die Aufschluss über den Zustand des Zellgewebes geben. Momentan werden hauptsächlich Endpunktanalysen (Zellfärbungen, Gen-, Proteinexpression) durchgeführt, die individuell an die jeweiligen Fragestellungen angepasst werden müssen. Eine allgemeiner anwendbare Alternative beruht auf der Messung von Stoffwechselvorgängen des Zellgewebes. Durch die Integration von Sensoren in mikrofluidische Systeme zur Echtzeit-Analyse der Zellvitalität werden Änderungen des Zellmetabolismus in den zeitlichen Zusammenhang mit Veränderungen der Kultivierungsbedingungen, z. B. der Zugabe und Entfernung von Medikamenten, gebracht. Dadurch kann die Aufklärung von Wirkmechanismen von bestimmten Stoffgruppen sehr viel umfassender erfolgen und die Untersuchung wiederholter Gaben (repeated Dose) sowie Kombinationsbehandlungen werden möglich. Erfasst werden z. B. die Zellatmung und die pH-Wert-Änderung in der unmittelbaren Umgebung der Zellen sowie die Glukose- und Laktatkonzentration im Zellmedium.

Analyse von Chemotaxis in mikrofluidischen Systemen

Chemotaxis bezeichnet die gerichtete Migration von Zellen im Konzentrationsgradienten einer stimulierenden Substanz und spielt eine zentrale Rolle bei vielen wichtigen biologischen Prozessen wie Embryonalentwicklung, Immunabwehr oder Krebs. Das Verständnis der zugrundeliegenden molekularen Mechanismen ist essentiell, wenn neue, an diesen Prozessen ansetzende Wirkstoffe entwickelt werden sollen. Leider können mit klassischen Chemotaxis-Assays die experimentellen Rahmenbedingungen zur Untersuchung von Chemotaxis oft nur unzureichend kontrolliert werden. Um diese Limitationen zu überwinden, verwenden wir mikrofluidische Systeme, mit denen hochgradig stabile Konzentrationsgradienten erzeugt und die Migration der stimulierten Zellen über Stunden dynamisch erfasst werden kann. Die Gradienten werden dabei unter laminaren Strömungsbedingungen durch Diffusion zwischen zwei parallelen Teilströmungen generiert. Durch die Variation von Strömungsgeschwindigkeiten kann die Steilheit des Gradienten eingestellt und dieser an verschiedenen Positionen im mikrofluidischen Kanal positioniert werden. Hierdurch kann die Stimulation von Zellen mit löslichen Faktoren örtlich und zeitlich sehr flexibel variiert und an die jeweiligen Versuchsbedingungen angepasst werden.

Calcium-Signale in Einzelzellen

Einzelzell-Analytik — © Fraunhofer IZI-BB
Gezielte Kontaktierung einer einzelnen T-Zelle mit einem funktionalisierten Mikropartikel in einem Mikrokanal. Der durch die Bindung der Zelle an die Partikeloberfläche ausgelöste Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration wurde mit einem Calcium-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff gemessen.

Die Wechselwirkung von Zellen mit ihrer Umgebung ist ein wirkungsvoller Mechanismus, zelluläre Zustände in vivo zu kontrollieren. Für die Entschlüsselung der dabei beteiligten Signaltransduktionsprozesse müssen definierte Ereignisse entlang der zellulären Signalkaskade erfasst und ihre wechselseitige Beziehung zueinander aufgeklärt werden. Dies kann von Ensemble-Messungen nicht geleistet werden, da die Mittelung biologischer Daten immer eine Missachtung der Variabilität des Antwortverhaltens individueller Zellen darstellt und dadurch verschwommene Resultate liefert. Nur eine Multiparameteranalyse auf Einzelzellebene kann die entscheidenden Informationen liefern, die für ein detailliertes Verständnis zellulärer Signalwege unabdingbar sind. In unserer Arbeitsgruppe entwickeln wir Techniken und Verfahren, mit denen die Mikroumgebung einzelner Zellen gezielt manipuliert werden kann, wodurch den Zellen lösliche bzw. oberflächengebundene Stimuli individuell und sehr kontrolliert präsentiert werden können. Die dabei ausgelösten zellulären Signaltransduktionsprozesse werden auf unterschiedlichen zeitlichen Ebenen analysiert. So können wichtige biologische Prozesse wie interzelluläre Kommunikation oder die Differenzierung von Zellen sehr präzise und unter reproduzierbaren Umgebungsbedingungen untersucht werden.

Analyse von Differenzierungsprozessen und »künstliche Stammzellnischen«

Wie wir heute wissen, wird die Differenzierung von Stammzellen im Organismus stark über ihre Mikro-Umgebung kontrolliert. Dabei spielen andere Zellarten sowie extrazelluläre Proteine eine zentrale Rolle. Über Veränderungen dieser sogenannten »Nische« wird der Stammzelle ein Signal gegeben, z.B. zu ruhen, sich zu vermehren oder zu differenzieren.

Leider ist die Beobachtung solcher Abhängigkeiten technisch schwierig, da man nicht mit einer flachen Schicht Zellen in Kultur arbeitet, sondern im werdenden Embryo oder im ausgewachsenen Organismus versuchen muss, einzelne Zellen zu verfolgen, zu mikroskopieren, zu färben und zu manipulieren, ohne einen unerwünschten Einfluss auf sie auszuüben. Dies wird teilweise an einfachen Organismen wie C. elegans (Fadenwurm) und D. melanogaster (Fruchtfliege) durchgeführt. An komplexeren Systemen, besonders im Menschen, hat man jedoch unüberwindbare Schwierigkeiten.

Wir entwickeln Ansätze, um die »Nische« von Stammzellen künstlich nachzubilden und sie so unter ein Mikroskop zu exportieren. Damit wird es möglich das Verhalten einzelner Stammzellen in ihrer physiologischen Umgebung zu studieren und wertvolle Erkenntnisse über Grundlagen wie Möglichkeiten zur Beeinflussung der Stammzell-Differenzierung zu gewinnen. Ein fernes Ziel ist dabei die kontrollierte Differenzierung und Präparation einzelner Zellen im Chipformat.

Methoden & Geräte

Etablierung von funktionalen Zell-Assays (z.B. Proliferation, Zytotoxizität, Chemotaxis, Neuritenwachstum, Stammzelldifferenzierung, Intrazelluläres Calcium, Intrazellulärer pH, etc.)
Optische Mikroskopie auf High End-Niveau (z.B. hoch lichtempfindliche Fluoreszenzmessungen, Zeitaufgelöste Fluoreszenzmikroskopie lebender Zellsysteme etc…)
Expressionsanalyse mittels Immunfärbungen und Western Blots
Detektion und Quantifizierung von zellulären und proteinergen Blutbestandteilen
Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop (Zeiss LSM510)
Vollautomatisierte Fluoreszenzmikroskope mit Klimatisierung zur Langzeitbeobachtung lebender Zellen (cellSens, Olympus)
Durchlicht- und Auflichtmikroskopie mit Hellfeld-, Phasenkontrast-, Fluoreszenz-, Polarisations- und Totalreflexionseinrichtung (TIRFM)
Systeme zur Echtzeitmessung des Sauerstoffverbrauchs (Opal, Colibri) und pH-Wert-Änderungen in Zellnähe

Publikationen

Flechner M, Schaller J, Stahl M, Achberger K, Gerike S, Hannappel Y, Fu J, Jaeger M, Hellweg T, Duschl C, Uhlig K. Adhesion, proliferation and detachment of various cell types on thermoresponsive microgel coatings. Biotechnol Bioeng. (2022), 1– 12.
Gehre C, Flechner M, Kammerer S, Küpper J-H, Coleman C D, Püschel G P, Uhlig K, Duschl C. Real time monitoring of oxygen uptake of hepatocytes in a microreactor using optical microsensors. Sci Rep (2020) 10, 13700.
Bavli D, Prill P, Ezra E, Levy G, Cohen M, Vinken M, Vanfleteren J, Jaeger MS, Nahmias Y. Real-time monitoring of metabolic function in liver-on-chip microdevices tracks the dynamics of mitochondrial dysfunction. PNAS (2016) 113, S. E2231-E2240.
Prill S, Bavli D, Jaeger MS, Schmälzlin E, Levy G, Schwarz M, Duschl C, Ezra E, Nahmias Y. A Real-Time Monitoring of Oxygen Uptake in Hepatic Microwell Bioreactor Reveals CYP450-Independent Direct Mitochondrial Toxicity of Acetaminophen multilayers. Archives of Toxicology, 90 (2016) 1181-1191. DOI dx.doi.org/10.1007/s00204-015-1537-2
Renner A, Jaeger MS, Lankenau A, Duschl C. Position-dependent chemotactic response of slowly migrating cells in sigmoidal concentration profiles. Appl Phys A. (2013), 112(3), 637-645.
Uhlig K, Wischerhoff E, Lutz JF, Laschewsky A, Jaeger MS, Lankenau A, Duschl C. Monitoring cell detachment on PEG-based thermoresponsive surfaces using TIRF microscopy. Soft Matter. (2010), 6, 4262-4267.
Habaza M, Kirschbaum M, Guernth-Marschner C, Dardikman G, Barnea I, Korenstein R, Duschl C, Shaked NT. Rapid 3D Refractive-Index Imaging of Live Cells in Suspension without Labeling Using Dielectrophoretic Cell Rotation. Adv. Sci. (2017), 4, 1600205
Kirschbaum M, Jaeger MS, Duschl C. Measurement of surface-mediated Ca2+ transients on the single-cell level in a microfluidic Lab-on-a-Chip environment. Methods Mol Biol. (2015);1272:247-56
Schreml S, Meier RJ, Kirschbaum M et al. Luminescent Dual Sensors Reveal Extracellular pH-Gradients and Hypoxia on Chronic Wounds That Disrupt Epidermal Repair. Theranostics. (2014), 4, S. 721-735.
Renner A, Jaeger MS, Lankenau A, Duschl C. Position-dependent chemotactic response of slowly migrating cells in sigmoidal concentration profiles. Appl Phys A. (2013), 112(3), 637-645.
Kirschbaum M, Jaeger MS, Duschl C. Correlating short-term Ca2+ responses with long-term protein expression after activation of single T cells. Lab Chip. (2009), 9, 3517-3525.
Kirschbaum M, Jaeger MS, Schenkel T, Breinig T, Meyerhans A, Duschl C. T cell activation on a single-cell level in dielectrophoresis-based microfluidic devices. J Chromatogr A. (2008), 1202, 83–89.