Membranproteinsynthese

Membranproteine sind in ihrer funktionellen und strukturellen Vielfalt eine der großen Stoffgruppen, die in hoher Qualität und Quantität in ständig zunehmenden Mengen benötigt werden. Gleichzeitig stellen Membranproteine jedoch eine Proteinklasse dar, die in lebenden Zellen besonders schwer herstellbar ist: Toxische Effekte, Proteinfehlfaltungen und die Bildung unlöslicher Proteinaggregate machen eine zellbasierte Membranproteinsynthese häufig unmöglich. Hier bieten zellfreie Systeme erstmals die Möglichkeit, in zeitsparenden und hocheffizienten Syntheseverfahren Membranproteine darzustellen, um diese unmittelbar einer Chip-basierten Funktionsanalytik zugänglich zu machen. Die Realisierung eines schnellen PCR-basierten Verfahrens zur Matrizenherstellung für die klonierungsfreie Membranproteinsynthese in pro- und eukaryotischen zellfreien Systemen sowie die Entwicklung spezifischer Vektoren für die effiziente zellfreie Proteinsynthese in Insektenzelllysaten und CHO-basierten Systemen stellen die Basis für die Synthese komplexer Membranproteine dar. Eukaryotische Proteinsynthesesysteme ermöglichen die Synthese von multimeren- und posttranslational modifizierten Membranproteinen. Modifikationen, wie Glykosylierung und Signalpeptidabspaltung sowie Lipidmodifikationen und Disulfidverbrückungen führen zur Steigerung der löslichen und funktionellen Proteinausbeute. Zusätzlich lassen sich neu synthetisierte Membranproteine in zellfreien eukaryotischen Systemen in Vesikel integrieren, um diese membranständigen Proteine einer nachfolgenden Analytik zugänglich zu machen.

Die Entwicklung von Systemen zur Analytik von Membranproteinen ist von grundlegender Bedeutung für die Identifizierung pharmazeutisch wirksamer Substanzen. Ein besonderer Fokus liegt dabei auf der pharmakologischen Charakterisierung, der Modifizierung und Funktionsuntersuchung zellfrei hergestellter Membranproteine. Insbesondere Ionenkanäle, Transportproteine und G Protein-gekoppelte Rezeptoren stehen im Fokus der Forschung. Durch die Einführung von Fluoreszenzgruppen an ausgewählten Positionen können multimere Membranproteine einer Analytik zugeführt werden. Der Einbau modifizierter nicht-kanonischer Aminosäuren während der Proteinsynthese wird mit Hilfe von chemisch oder enzymatisch präazylierter tRNAs durchgeführt. Definierte Proteinkonjugate mit biotinylierten oder fluoreszenzmarkierten Gruppen werden sowohl in pro- als auch in eukaryotischen zellfreien Systemen hergestellt. Die ortsspezifische Proteinmarkierung dient dabei als schonend anzuwendende Methode für die Funktionsanalyse der synthetisierten Membranproteine. Ligandgesteuerte und spannungsabhängige Ionenkanäle werden hierbei elektrophysiologisch charakterisiert und im Hinblick auf die Identifizierung neuer Pharmaka analysiert.

Leistungsangebot

• Pharmakologische Charakterisierung und Modifizierung von Membranproteinen: insbesondere Untersuchungen von Ionenkanälen, Transportproteinen und G-Protein-gekoppelten Rezeptoren
• Analyse von multimeren Membranproteinen
• Ortsspezifische Proteinmarkierung zur Funktionsanalyse